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为什么PCR有时候出带,有时候不出带
那可能PCR反应进行的不好，没有得到充足的DNA片段 建议改善反应条件，重新做一便．你看下这个步骤： 基因组DNA 的制备 参照萨姆布鲁克等(1996) 的方法略加改进，取足肌约100 mg 切碎并溶于裂解液中，加入蛋白酶K 至终浓 度为100μg/ ml ，充分混匀后37 ℃消化4～5 h 。
⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。
buffer和Taq酶没有拿错别的 其次，你的引物和模版是如何保存的？会不会因为保存不当而降解了。
看看能不能P出来，如果能，建议直接换NEB 的 phusion做PCR，我用过的PCR酶中，phusion的保真性和扩增效率相对其他而言都是最好的。质粒应该更容易扩增出目的片段，你用你的质粒做模板做个梯度PCR看看能不能出有没有出目的带的，若梯度没出估计你第一次出带有可能有污染。
做pcr，要时刻记着这6个：模板，引物，taq酶，dNTP，mg2+，温度及其他条件控制。设计实验围绕的是这6个中心环节，而troubleshooting也要从这6个方面入手，一项项排查 孔的大小应该不会是造成条带问题的原因。建议你筛查一遍，从污染、操作顺序、加量多少等分别排查，是否有不当之处。
PCR相关的问题
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。（7）退火温度过低。（8）电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。
PCR实验注意的关键问题有实验前的准备、引物设计、模板的质量和浓度、反应条件等。实验前的准备：PCR实验需要使用精密的仪器和试剂，因此实验前的准备工作非常重要。首先，要确保实验场地清洁、安全，并且符合实验要求。
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。对策为：选定一个好的引物合成单位。
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